MICROSCOPIO

Parte mecánica:

-          Sistema de soporte o estativo:
o        Pie
o        Brazo
o        Tubo
o        Platina
o        Revolver

-          Sistema de ajuste:
o        Tornillo macrométrico
o        Tornillo micrométrico

Parte óptica:

-          Fuente de iluminación

-          Condensador y diafragma

-          Lentes: oculares (10x y 12x) y objetivos (4x, 10x, 40x y 100x).

* PIE: Sirve como base del microscopio y tiene un peso suficiente para dar estabilidad al aparato. En los microscopios antiguos tenía forma de herradura o de trípode pero en la actualidad suele ser una plataforma rectangular. En él se integra la fuente luminosa.

* BRAZO: Es una columna perpendicular al pie. Puede ser arqueado o vertical y une al pie con el tubo.

* TUBO: Es una cámara oscura unida al brazo mediante una cremallera. Tiene el revolver con los objetivos en su parte inferior y los oculares en el extremo superior.

* PLATINA: Es una plataforma horizontal con un orificio central, sobre el que se coloca la preparación, que permite el paso de los rayos procedentes de la fuente de iluminación situada por debajo. Dos pinzas sirven para retener el portaobjetos sobre la platina y un sistema de cremallera guiado por dos tornillos de desplazamiento permite mover la preparación de delante hacia atrás o de izquierda a derecha y viceversa. En la parte posterior de uno de los laterales se encuentra un nonius que permite fijar las coordenadas de cualquier campo óptico; de esta forma se puede acudir a el cuando interesa.

* REVOLVER: Es un sistema que coge los objetivos, y que rueda para utilizar un objetivo u otro.

* TORNILLOS MACRO Y MICROMÉTRICO: Son tornillos de enfoque, mueven la platina hacia arriba y hacia abajo. El macrométrico lo hace de forma rápida y el micrométrico de forma lenta. Llevan incorporado un mando de bloqueo que fija la platina a una determinada altura.

* FUENTE DE ILUMINACIÓN: Se trata de una lámpara halógena de intensidad graduable. Esta situada en el pie del microscopio. Se enciende y se apaga con un interruptor y en su superficie externa puede tener una especie de anillo para colocar filtros que facilitan la visualización.

* CONDENSADOR Y DIAFRAGMA: El condensador es un sistema de lentes situadas bajo la platina su función es la de concentrar la luz generada por la fuente de iluminación hacia la preparación. En el interior del condensador existe un diafragma (iris) cuya función es limitar el haz de rayos que atraviesa el sistema de lentes eliminando los rayos demasiado desviados (regula la cantidad de luz y ajusta la Apertura Numérica).

* OCULARES: Están colocados en la parte superior del tubo. Se denominan así, porque están muy cercanos al ojo. Su función es la de captar y ampliar la imagen formada en en los objetivos. En los modernos microscopios hay dos oculares (microscopios binoculares) que están unidos mediante un mecanismo que permite ajustar la distancia interpupilar. En general los mas utilizados son los de 10X ( producen un aumento de 10 veces ).

* OBJETIVOS: Están colocados en la parte inferior del tubo insertados en una pieza metálica, denominada revolver, que permite cambiarlos fácilmente. Generan una imagen real, invertida y aumentada. Los mas frecuentes son los de 4, 10, 40, y 100 aumentos. Este último se llama de inmersión ya que para su utilización se necesita utilizar aceite de cedro sobre la preparación. En la superficie de cada objetivo se indican sus características principales, aumento, apertura numérica, y llevan dibujado un anillo coloreado que indica el número de aumentos (rojo 4X, amarillo 10X, azul 40X y blanco 100X).

Las partes de un microscopio Los dos sistemas de lentes de un microscopio óptico compuesto se denominan lente objetivo, la que está mas cercana al espécimen, y lente ocular, que está en la pieza del ocular del microscopio. Los microscopios modernos llevan la fuente de luz incorporada. En laFigura 3.6 se puede observar el recorrido de la luz desde la f'uente luminosa, en la base del microscopio, hasta el ojo del obsenador. La luz pasa frecuentemente a través de un filtro azul (para eliminar Iongitudes de onda largas) y a través de otra serie de lentes que constituven el condensador. El condensador tiene como función dirigir la luz sobre el espécimen, donde parte de la misma es absorbida y parte difractada. La luz transmitida entra en la lente objetivo, que forma una imagen en eltubo del microscopio. Posteriormente la lente ocular aumenta la imagen y la proyecta en la última lente de la serie la de nuestro propio ojo. El ojo forma una imagen en la retina y el cerebro la percibe.

Un microscopio compuesto ordinario proporciona una iluminación de campo claro. Esto es debido a que el condensador dirige la luz a través del espécimen, y el fondo queda iluminado de forma brillante. Los microscopios compuestos pueden ser modificados para ver un espécimen mediante (1) contraste de fases, (2) campo oscuro, (3) fluorescencia, o (4) por contraste diferencial de interferencia (Nomarsky); todos estos métodos se describirán más tarde.

Poder total de aumento Casi todos los microscopios compuestos poseen varias lentes objetivos, cada una con un poder de aumento diferente. Normalmente, existe una lente de bajo poder (objetivo débil seco) que aumenta un objeto 10 veces (l0x), una de alto poder (objetivo fuerte seco), que aumenta 40 veces (40x) y el objetivo de inmersión, 100 veces (l00x). Casi todas las lentes del ocular proporcionan un aumento adicional de 10 veces (l0x). Se puede calcular el poder total de aumento de un microscopio multiplicando cl aumento que proporcionan las dos lentes, objetivo y ocular, en uso. (Véase la Tabla 3.1, en la cual se incluyen tres ejemplos.) Si se desea observar la apariencia general de un espécimen es recomendable usar un objetivo de bajo poder, porque su campo de visión es grande. El objetivo de inmersión tiene un campo de visión pequeño, pero proporciona mas detalles de la imagen (Figura 3.7).

Casi todos los microorganismos requieren, antes de ser examinados en un microscopio óptico, una preparación especial; esto es debido a que poseen poco contraste natural. La preparación y la tinción (tratamiento con colorantes) de un espécimen son fundamentales si se desea obtener buenas imágenes. Muchas décadas de esfuerzos y errores han conducido a métodos generales de preparación que resultan idóneos. A continuación describiremos la observación en fresco de microorganismos vivos y varios tipos de tinciones.

Tabla 3.1. Aumento Total
Microscopio	Lente objetivo		Lente ocular		Ampliación total
Microscopios ópticos
Debil seco	10x	x	10x	=	l00x
Fuerte seco	40x	x	10x	=	400x
Aceite de inmersión	100x	x	10x	=	1000x

Microscopios electrónicos
Transmisión (MET)					~200000x
Barrido (MEB)					~10000x

 

Figura 3.6 El camino de la luz en el microscopio compuesto. La luente de luz está en la base. El condensador enfoca el haz de luz sobre el espécimen, donde parte se absorbe, parte se refracta, y parte se transmite. La luz transmitida penetra en la lente objetivo, que aumenta la imagen. El prisma hace que la imagen se forme en el tubo del microscopio, haciendo la visión más cómoda. La lente ocular vuelve a aumentar la imagen y la enfoca en el ojo.

3.1.4 Preparaciones en fresco

La forma más simple de preparar un espécimen para su examen microscópico es hacer unapreparación en fresco. Existen dos técnicas, una preparación en fresco simple ("entre porta y cubre") consiste en colocar una gota de líquido con los microorganismos sobre un portaobjetos y a continuación cubrirla con un cubreobjetos. Una preparación en gota pendiente se realiza colocando una gota del material en un cubreobjetos y cubriéndolo con un portaobjetos (invertido) con una excavación central (portaobjetos excavado) (Figura 3.8). Hay que sellar la preparación con vaselina alrededor de la excavación. La ventaja de esta última técnica, es que la preparación no se seca y puede ser observada durante un tiempo más largo.

Las preparaciones en fresco se utilizan para observar microorganismos vivos. Por ejemplo, para la búsqueda de Trichomonas vaginalis en secreciones vaginales. Este protozoo de gran movilidad causa inflamación de la vagina y la uretra. Si en la preparación se observan células en forma de huso que se mueven mediante contracciones o sacudidas cruzando el campo, probablemente se tratará de T. vaginalis, pudiéndose efectuar el diagnóstico.

Sin embargo, el inconveniente de la observación en fresco es que no permite aumentar el contraste de la preparación. Por tanto, su uso, con un microscopio óptico de campo claro, está bastante limitado. Normalmente, para observar microorganismos vivos se utiliza alguno de los otros microscopios ópticos que hemos mencionado anteriormente.

 

Figura 3.7 El microscopio compuesto tiene tres lentes objetivos (tres sistemas de lentes). Se muestra el mismo campo de Bacillus subtilis visto con el objetivo débil seco (100x), fuerte seco (400x), y con el de inmersión (l000x). Los aumentos mayores revelan progresivamente más detalle de una porción de campo menor.

 

Figura 3.8 Preparación en gota pendiente. Esta preparación se realiza colocando una gota de la suspensión bacteriana en un cubreobjetos en el cual se ha hecho previamente un círculo con vaselina o parafina (a). La vaselina actúa como sellador. (b) Sobre el cubreobjetos se coloca un portaobjetos con una excavación central que queda adherido gracias a la vaselina (c). Se invierte la preparación y se observa colocándola en la platina del microscopio (d). Las preparaciones en gota pendiente se utilizan para observar microorganismos vivos.

  

3.1.5 Tinciones

El microscopio de campo claro es más útil para la observación de especímenes teñidos. Los colorantes son compuestos químicos utilizados para aumentar el contraste. Existen algunos, llamados colorantesvitales, que pueden añadirse directamente a una preparación en fresco; por tanto, colorean células vivas. No obstante, la mayoría de los colorantes son solamente efectivos después de que los microorganismos hayan sido fijados, es decir, se encuentren muertos y adheridos al portaobjetos. Para la fijación por calor, se realiza una fina extensión de una gota de muestra líquida sobre un portaobjetos y se deja secar al aire; a continuación, se pasa la preparación de Forma rápida sobre la llama de un mechero. El calor de la llama mata las células microbianas por desnaturalización de sus proteínas. Las proteínas coaguladas unen las células al porta. Cuando se desea fijar especimenes delicados se utiliza la fijación química, va que es menos lesiva que el calor. Para ello se añade una gota del fijador, por ejemplo, ácido ósmico, formaldehído, o glutaraldehído, sobre la muestra líquida con los microorganismos.

La fijación posee algunos inconvenientes. Por ejemplo, a menudo distorsiona la apariencia real de las células, lo cual dificulta la identificación; además, no permite la observación del movímiento de los microorganismos. Después de la fijación, se añade el colorante, que debe permanecer el tiempo suficiente en contacto con el espécimen, para que pueda ser absorbido. A continuación, se retira el exceso de colorante, normalmente lavando con agua.

Tipos de colorantes Casi todos los colorantes son sales, compuestos formados por iones cargados. Los colorantes básicos son aquellos en los cuales el agente que tiñe es el ion cargado positivamente, mientras que en los ácidos, el colorante es el ion cargado negativamente. Los colorantes más utilizados son los de tipo básico, va que la mayor parte de las células microbianas Poseen cargas débilmente negativas en su superficie, lo cual facilita su unión. Entre los colorantes básicos más comunes se encuentran la safranina, la fucsina básica, el cristal violeta y el azul de metileno. Los colorantes ácidos se unen a las partes de las células cargadas positivamente. Se utilizan para teñir tejidos animales infectados con microorganismos. Entre los más frecuentes están la eosina, la fucsina ácida y el rojo Congo.

TABLA 3.2 Técnicas de tinción para bacterias
Tinción	Uso	Técnicas
Tinciones simples	Un colorante; proporciona contraste para observar mejor un organismo completo	Se tine con un colorante básico (azul de metileno, cristal violeta, o fucsina básica) durante unos 5 minutos. Aclarar brevemente con agua. Se tiñen casi todas las bacterias; la rnayoría de los tejidos no se tiñen.
Tínciones diferenciales
Tinción de Gram	Dos o más colorantes; distingue entre bacterias Gram positivas y Gram negativas	Se cubre la preparación de bacterias fijadas con cristal violeta y después con una solución de iodo (mordiente). Todas las células quedan tenidas de color violeta oscuro. Se decolora con acetona al 95%. Las células Gram positivas permanecen tenidas, pero las negativas pierden el colorante. Se tiñe con safranina (contraste). El color violeta de las Gram positivas se vuelve más oscuro y las Gram negativas se tiñen de rosa.
Tinción de ácido-alcohol resistencia (Ziehl-Neelsen)	Dos colorantes; distingue entre las micobacterias (ácido-alcohol resistentes) y el resto de las bacterias	Se tiñen las células con fucsina básica y se calienta a emisión de vapores durante 5 minutos. Todas las bacterias se tinen de rojo. Se decolora brevemente con una mezcla de alcohol-HCl. Las bacterias resistentes permanecen teñidas de rojo; todas las demás se decoloran. Se trata con el colorante de contraste azul de metileno. Las bacterias ácido-alcohol resistentes continúan tenidas de rojo, las otras se tiñen de azul.
Tinciones especificas
Tinción de esporas de Wirtz-Cortitlin	Tiñe selectivamente las endosporas	Se cubre la preparación con verde de malaquita y se calienta a emisión de vapores durante 60 segundos. Se lava con agua durante 30 segundos y se tiñe con safranina. Las endosporas retienen el color verde; el resto de la célula toma el color rosa.
Tinción de flagelos de Leifson	Permite observar los flagelos	A las células previamente fijadas, se le añade una mezcla de ácido tánico (mordiente) y del colorante rosanilina. El mordiente engruesa los flagelos y el colorante los fine.
Tinción negativa	Revela la presencia de cápsulas	Se utiliza tinta china o nigrosina para tenir una preparación en fresco del espécimen. Las particulas de colorante no pueden penetrar en la cápsula, que se observa como una región clara alrededor de la célula.